Comment sélectionner la résine de chromatographie dont vous avez besoin

La chromatographie est une technique largement utilisée en chimie pour séparer un mélange, en le faisant passer, alors qu'il est à l’état de solution, de suspension ou bien de vapeur, à travers un milieu qui interagit avec les éléments constituant ce mélange, lesquels se déplacent à des vitesses différentes. Ce mouvement obéit aux caractéristiques propres à chaque type de molécule, ce qui permet de séparer ou de purifier un composant donné à partir d'un échantillon complexe.

En chromatographie en phase liquide, on utilise un milieu résine pour capturer et polir des fragments d'anticorps, des vaccins, et d'autres biomolécules à l’aide d'une phase stationnaire. Ce processus sépare un échantillon en éléments individualisés, ce qui permet d'isoler et de purifier des molécules. Il implique deux substances : une phase stationnaire et une phase mobile.

Lors d’une biotransformation, on ajoute un échantillon à une phase stationnaire, puis on le fait se déplacer à travers elle en ajoutant la phase mobile. Ces deux étapes nécessitent l’utilisation d'un milieu donné.

La résine de chromatographie constitue la pierre d’achoppement de ces processus, car elle permet aux réactions chimiques d'avoir lieu en vue de la séparation et de la purification. Lorsque vous choisissez la résine de chromatographie la plus adaptée à votre procédure, il est essentiel de commencer par évaluer les éléments suivants :

  • Quelles sont les caractéristiques connues de votre molécule-cible ?
  • Quelles sont les caractéristiques de votre échantillon, et ses impuretés ?
  • Quels sont les résultats de traitement que vous souhaitez obtenir (purification ou analyse) ?
  • Quel type de chromatographie en phase liquide répond le mieux aux exigences de votre expérience ?

On peut affiner la sélection d’une résine de chromatographie en examinant vos besoins spécialisés de traitement. Partant de la structure du matériau constituant votre échantillon, vous pouvez tirer partie des résines avec différentes propriétés des acides nucléiques, des protéines et des petites ou grosses molécules, et ce, afin d’exclure ou de capturer des cibles intéressantes présentes dans un mélange.

Selon les propriétés physiques et chimiques de votre échantillon, il existe un schéma de purification idéal. On peut définir facilement celui-ci par une compréhension de base des différentes catégories de résines de chromatographie et des techniques correspondantes.

Que sont les résines de chromatographie ?

Les résines utilisées en chromatographie, également connues sous le nom de milieu, constituent le matériau utilisé pour capturer et polir des mAbs, des fragments d'anticorps, des vaccins, et d'autres biomolécules lorsqu'on effectue des séparations chromatographiques.

Lorsqu'on a recours à une résine de chromatographie, le milieu est emballé et maintenu dans une colonne pendant la phase stationnaire. Ces particules peuvent être modifiées physiquement ou chimiquement afin de fournir la spécificité permettant de lier ou de repousser certaines molécules dans un échantillon. Cette méthode peut s’avérer particulièrement utile car ce processus est en mesure de séparer un composé-cible, y compris à partir d'un mélange ultra-complexe.

Ces colonnes fonctionnent typiquement à l’aide de la gravité pour pouvoir déplacer l’échantillon en solution, mais, de plus en plus souvent, ces colonnes fonctionnent avec différents niveaux de pression via les pompes mécaniques. Différent milieux résines sont proposées pour répondre à une multitude de besoins lorsque les chercheurs purifient un ensemble divers de molécules-cibles.

Lorsqu'on réalise une chromatographie, on a deux phases distinctes : la phase stationnaire et la phase mobile. La principale différence entre ces deux phases réside dans le fait que la phase stationnaire ne se déplace pas avec l’échantillon, alors que la solution de phase mobile se déplace avec l'échantillon. Dans la phase stationnaire, on utilise fréquemment un milieu résine, alors que dans la phase mobile, il s'agit souvent d'une solution liquide ou gazeuse contribuant à la séparation des matériaux constituant l’échantillon.

Ces deux phases entretiennent différentes interactions avec l’échantillon, la phase stationnaire ne se déplaçant habituellement pas, mais interagissant toujours avec l’échantillon. Il se peut qu’une solution de phase mobile dissolve l'échantillon, et qu’elle migre à travers la phase mobile en même temps que cet échantillon. Ces solutions doivent être compatibles pour garantir le succès de la séparation. Pour plus d'informations sur les techniques et réactifs chromatographiques, explorez les ressources complètes d’Avantor® en matière de solutions de chromatographie.

Ici, nous nous concentrerons sur les résines de chromatographie utilisées dans la phase stationnaire de la chromatographie, et le processus de sélection du milieu le mieux adaptés à votre application.

Résine de chromatographie de purification contre celle d'analyse

On peut effectuer une chromatographie en phase liquide à la fois à l'échelle de l’analyse ou de la préparation. D'un point de vue analytique, l’objectif consiste souvent à découvrir, identifier et quantifier une molécule cible contenue par l’échantillon. Alors que dans la chromatographie liquide préparative, l'accent est mis sur l'isolement et la purification des composés en utilisant une technique de biotraitement en aval.

La purification des protéines peut poser de nombreux problèmes, et elle nécessite une optimisation des protocoles pour chaque phase du protocole. Que votre processus consiste à sélectionner les molécules de manière plus générale, ou à effectuer une séparation ultra-spécifiques, on peut faire son choix parmi de nombreuses méthodes de chromatographie.

Certaines cibles peuvent nécessiter un processus de séparation multi-étapes, avec des montages de chromatographie sur colonne multiples, alors que d’autres peuvent avoir besoin d'une solution mixte milieu et résine afin de répondre aux besoins spécifiques de la recherche. Dans l’idéal, vous obtiendrez une méthode nécessitant le moins d'étapes possible pour obtenir une version purifiée de votre molécule cible.

Ci-dessous, nous vous dévoilerons certaines formes de chromatographie en phase liquide comptant parmi les plus courantes, en mettant en avant les résines utilisées et leurs avantages respectifs.

Les techniques de chromatographie basées sur la sélection des résines de chromatographie

Lorsqu’on commence par évaluer vos méthodologies, la séparation de certains matériaux depuis un échantillon complexe peut s'avérer être une tâche à la fois difficile et laborieuse. Toutefois, une technique de purification correcte est fondamentale dans les processus permettant de caractériser davantage et de mieux comprendre la fonction d'une molécule-cible.

Malgré les nombreuses variables en jeu, il existe quelques domaines-clés sur lesquels il faut se concentrer lorsqu'on décide de la bonne technique pour traiter le matériau constituant votre échantillon.

Il est mieux de commencer par la séquence primaire d'acides aminés de votre cible. Si vous comprenez cet élément, vous obtiendrez des informations sur le poids moléculaire, le point isoélectrique (pl), et les caractéristiques de solubilité de la molécule-cible.

Cette information vous servira de guide de sélection du milieu de chromatographie adapté, mais aussi des conditions idéales de lavages et d’élution qui seront réunies lors du processus de purification.

Lorsque votre composé-cible n’est pas bien compris, il existe des résines multimodales ou en mode mixte pour la découverte et la purification préliminaires. D’autres méthodes tels que les graphiques d'hydrophilie et la prédiction de la structure secondaire peuvent fournir un guidage lorsqu’on envisage de recourir à une chromatographie d’interaction hydrophobe ou à des résines en mode mixte.

De plus, il existe des techniques telles que les chromatographies d'exclusion stérique, échangeuse d'ions, d'affinité, et d'exclusion stérique, lesquelles peuvent vous permettre d’obtenir les meilleurs résultats pour vos processus de séparation et de purification. Chacun de ces processus peuvent être personnalisés et exécutés pour répondre à vos besoins uniques. Pour comprendre quels sont les avantages de chacune de ces techniques, nous avons détaillé ci-dessous les formes les plus courantes de chromatographie, et précisé quelles sont les résines nécessaires à la réussite de chacune de ces procédures.

Les quatre résines les plus courantes en chromatographie

Lorsque vous réfléchissez au type de résine de chromatographie la mieux adaptée à vos besoins, vous avez quatre catégories-phares. Des facteurs tels que le degré de pureté, la charge en surface de votre protéine-cible, la taille des molécules, ou même la manière dont l’eau interagit avec votre échantillon, sont essentiels au choix de la résine idéale.

Explorons plus en détails les types spécifiques de résine, en fonction des différentes techniques de chromatographie.

Chromatographie d’affinité (AC)

Cette forme ultra-précise de chromatographie permet d’obtenir un degré de pureté élevé en une seule étape. La chromatographie d’affinité (AC) sépare les molécules-cibles à l’aide d'une interaction forte mais réversible entre la protéine de l’échantillon et un ligand spécifique. Cette interaction de liaison immobilise le ligand avec une résine, en même temps que le composé ciblé.

La liaison et la purification de cette technique est hautement sélective, et tire parti de la structure ou de la fonction biologique de la protéine-cible. La chromatographie d’affinité permet de purifier des molécules natives comme des molécules générées par recombinaison ; c’est pourquoi il s'agit d'une méthode de choix, polyvalente et précise.

Certains exemples d'application comprennent les interactions anticorps/antigène, enzyme/substrat et enzyme/inhibiteur. Sélectionner les ligands appropriés pour une chromatographie d'affinité constitue la clé d'un processus réussi. De nouveaux ligands sont à présent proposés sur le marché, plus économiques, et permettant des structures chimiques plus stables.

La chromatographie d’affinité permet une meilleure sélectivité, et fournit souvent des résultats plus rapides grâce à une interaction aussi spécifique, ce qui fait de la chromatographie d’affinité l'étape primaire la plus courante (et parfois même, la seule étape) d'un processus de purification.

Chromatographie échangeuse d'ions (IEX)

La chromatographie échangeuse d'ions fonctionne en séparant les molécules en fonction de leur charge globale en surface. Cette interaction est également réversible, et on peut l’effectuer en sélectionnant une résine de chromatographie ayant la charge opposée au composé-cible présent dans votre échantillon.

Les résines échangeuses d'ions ont été créées par liaison covalente de groupes fonctionnels chargés soit positivement, soit négativement, avec une matrice solide. Certains des milieux les plus couramment utilisés incluent la cellulose, l’agarose, le polyméthacrylate, le polystyrène, et le polyacrylamide.

Un échantillon de protéines est chargé dans une colonne IEX à une faible force ionique, puis lavé à l’aide de tampons ayant une force ionique en augmentation, et ce, afin d'éliminer les particules et impuretés indésirables. Ensuite, on élute la protéine-cible à l’aide soit de gradients de sel définis, soit d’un changement de pH. Lorsqu'on effectue une élution par le sel, il est possible qu’un traitement ultérieur soit nécessaire lors de la préparation, avant de charger la colonne, alors qu'une élution par pH peut fonctionner sans cette étape supplémentaire. C’est parce que l’exposition au changement de pH fera en sorte que la protéine-cible ne portera plus une charge nette, qui sera libérée de la résine (exploitant le point isoélectrique de la protéine-cible).

Cette technique de chromatographie est idéale à la fois pour cibler des anticorps monoclonaux, et à titre de seconde étape de purification après la chromatographie d’affinité. De plus, une résine IEX à grosses billes constitue un bon point de départ pour la première purification par colonne.

Chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC)

Cette technique permet de séparer et de purifier les protéines et d'autres molécules biologiques selon le degré d’hydrophobicité de leur surface. Cette méthodologie est utile pour séparer et purifier des protéines tout en préservant l’activité biologique de ces dernières. La HIC a recours à des tampons, des matrices et des paramètres qui dénaturent moins l'échantillon que les autres méthodes, ce qui la rend idéale pour les expériences nécessitant d'avoir des échantillons intacts, et contrôlés en fonction d'autres caractéristiques biologiques.

La concentration en sel, le pH et la température peuvent affecter les interactions de liaison avec le milieu, ou même les propriétés chimiques des ligands qui sont immobilisés dans la résine.

On utilise couramment la HIC en conjonction avec l’élution IEX en amont à haute teneur en sel, et avec des procédures en aval de purification par exclusion stérique.

Chromatographie d'exclusion stérique (SEC)

Cette méthodologie légèrement différente a recours à un milieu sur gel afin de répartir les protéines selon leur taille. Avec cette technique, ces molécules ne vont pas se lier à la résine de chromatographie, mais, au lieu de cela, elles passent à travers la filtration sur gel.

Le gel SEC est constitué de billes sphériques munies de pores spécifiques à leur taille, pour inclure ou exclure les molécules dans le milieu. La séparation a lieu lorsque l'échantillon passe à travers la colonne, et celui-ci est élué afin de faire diminuer le poids moléculaire.

La faction et l’échange désalinisation/tampon sont les deux procédures SEC les plus communes. On utilise ces techniques lorsque les méthodes IEX ou HIC, par exemple, ne pourront pas séparer les protéines au degré de purification désiré. On utilise souvent la SEC comme étape finale lors de la purification des protéines.

Chromatographie multimodale (MM)

On utilise couramment la chromatographie en mode mixte comme étape de polissage lors de la purification des molécules biologiques. La MM a recours à des résines fonctionnalisées avec des ligands capables d’interagir de manière multiple, ce qui rend cette méthode utile pour purifier des molécules-cibles sans spécificité connue.

On peut utiliser cette technique pour discriminer, purifier et potentiellement identifier des sites sur une protéine-cible pouvant fournir des informations utiles sur l’affinité et la sélectivité.

L’une des limites de cette méthode réside dans le fait que l’interaction-cible ne peut pas être prédite à partir d’une simple analyse de la séquence des acides aminés, car les propriétés de liaison et d'élution sont multiples. Cela nécessite des étapes supplémentaires d’expérimentation initiale sur les conditions de liaison et d'élution.

Les principaux avantages de la chromatographie MM résident dans la combinaison de méthodes de chromatographie complémentaires lorsqu’on utilise un média unique. On peut ainsi faire l’impasse sur les étapes de purification et minimiser l’utilisation de matières précieuses contenues dans l’échantillon. Dans certains cas, elle permet de fournir des résultats plus rapides, notamment en présence d’impuretés similaires à la molécule-cible du point de vue de leur constitution.

Conclusion

Les résines de chromatographie constituent un outil essentiel pour la recherche et le développement, et elles fournissent aux scientifiques des résultats rapides et fiables grâce à leur mode d'interaction unique avec un échantillon. Trouver un milieu résine compatible est essentiel à la réussite de l’analyse et de la purification.

La démarche de sélection de la résine de chromatographie adaptée ne doit pas constituer un défi, malgré les nombreuses variables à prendre en compte lorsqu'on explore les différentes options. Avec une compréhension approfondie de votre échantillon, et les objectifs que vous souhaitez atteindre, les personnalisations qui vous sont proposées pour perfectionner vos protocoles de laboratoire sont illimitées.

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