Préparation d’un échantillon de protéine pour la spectrométrie de masse
Préparation d’un échantillon de protéine
Pour pouvoir réussir une analyse par spectrométrie de masse, vous devez préparer convenablement votre échantillon. Cette préparation comprend un certain nombre d’étapes pouvant être spécialisées en fonction de la nature de votre échantillon.
Généralement, un échantillon sera soumis à un processus de plusieurs étapes incluant la purification, la digestion, la déplétion et l’enrichissement. Certaines de ces étapes peuvent avoir lieu plus d'une fois, selon le type de la cellule et l'abondance de la protéine cible, ainsi que de la composition de l’échantillon.
Préparation d’un échantillon de protéine pour la spectrométrie de masse
Il faut prendre en considération un certain nombre de facteurs lors de la préparation d’un échantillon de protéine pour la spectrométrie de masse. La conception d’une stratégie de préparation d'échantillon devrait tenir compte de ce qui suit : la source et les propriétés physiques de l’échantillon, l'abondance des protéines cibles, ainsi que la complexité et la localisation cellulaire des protéines. La compréhension de ces éléments de votre échantillon limitera les procédures de spectrométrie de masse possibles. L’utilisation de techniques spécialisées pour sélectionner des protéines cibles peut s'avérer nécessaire pour travailler avec des échantillons complexes. Les flux de travail peuvent devoir inclure :
- Lyse cellulaire optimisée
- Fractionnement subcellulaire
- Déplétion de protéines abondantes
- Enrichissement de protéines sélectionnées
- Outil de marquage de masse
Chacune de ces étapes peut jouer un rôle clé dans la production de résultats précis dans la détection ou l’isolement des protéines.
Préparation du lysat
La lyse physique est une technique utilisée pour perturber les cellules et en extraire des contenus cellulaires. Elle requiert un équipement et des protocoles spécialisés, l'appareil variant souvent significativement. Cela peut ressembler à une différence des paramètres de sonication ou même à différents pilons.
La lyse cellulaire perturbe les compartiments cellulaires, activant des protéases et des phosphatases endogènes. Il est donc important de protéger les protéines extraites de toute dégradation causée par les activités de ces enzymes. Ceci est possible en ajoutant un inhibiteur de protéases et/ou de phosphatases aux réactifs de lyse.
L’exécution de la lyse cellulaire connaît quelques limitations qui pourraient nécessiter des alternatives ou des techniques de traitement supplémentaires. La lyse n’est généralement pas propice à la manipulation d’échantillons en petits volumes ou à haut débit. Les méthodes de lyse physique en soi ne solubiliseront pas des protéines associées à la membrane.
Toutefois, les méthodes de lyse à base de réactif peuvent lyser des cellules tout en solubilisant les protéines. Il est possible d’optimiser la lyse cellulaire en fonction du type de cellule respectif ou de la fraction de protéine requise en utilisant différents tampons, détergents, sels et réducteurs.
Pour maintenir l’intégrité de la protéine cible, il peut être nécessaire d'ajouter certains détergents, puis de les retirer pour étudier convenablement les protéines. En procédant ainsi, la stabilité de la protéine extraite sera maintenue à long terme.
Déplétion et enrichissement
L’objectif des stratégies de déplétion et d’enrichissement est de retirer des protéines très abondantes ou d'isoler des protéines cibles dans l’échantillon.
La déplétion est souvent utilisée pour réduire la complexité de l’échantillon biologique (tel que pour le sang ou le sérum qui contient des concentrations élevées d’albumine et d’immunoglobulines). Les techniques d’immunoaffinité comme l’immunoprécipitation, la co-immunoprécipitation et les kits commerciaux sont tous disponibles pour exécuter la déplétion sur un échantillon. L’unique inconvénient significatif de cette technique est le fait que les protéines abondantes se lient à d'autres protéines, ce qui entraîne la déplétion de complexes de protéines peu abondantes.
L’enrichissement des protéines isole des sous-classes de protéines cellulaires. Ceci peut être réalisé en utilisant un certain nombre de techniques identifiant : une activité biochimique unique, des modifications post-traductionnelles (PTM) ou la localisation spatiale dans une cellule. Les protéines peuvent aussi être enrichies en utilisant des composés spécifiques à une classe d’enzymes ou des réactifs de marquage imperméables aux cellules qui marquent de manière sélective les protéines de surface cellulaire.
La séparation de fractions subcellulaires distinctes peut être utilisée comme méthode d’enrichissement. Ceci peut être réalisé à l'aide de techniques de perturbation physique, de solutions détergent-tampon et de méthodes de gradient de densité. Ce type de séparation est idéal dans les cas où il est tenté d’extraire une protéine membranaire hydrophobe d'une protéine hydrophile.
Enfin, la centrifugation à gradient de densité est une autre technique idéale pour isoler les noyaux intacts, les mitochondries et d'autres organites avant la solubilisation des protéines.
Dialyse et dessalage
Des étapes supplémentaires comme la dialyse et le dessalage peut être nécessaire pour s'assurer qu’un échantillon est compatible et optimisé pour la digestion et l'analyse par spectrométrie de masse.
La spectrométrie de masse mesure les ions chargés, ce qui signifie qu’il faut retirer les sels avant de procéder à la MS pour minimiser leur détection (en particulier les sels de sodium et de phosphate). La dialyse et le dessalage permettent de remplacer le tampon et de retirer de petites molécules pour éviter toute interférence avec les processus en aval.
Dénaturation et digestion des protéines
La digestion peut être effectuée tant en solution que par électrophorèse sur gel à 1 ou 2 dimensions. L’utilisation d’une technique plutôt que l’autre se résume à deux facteurs principaux : la quantité d’échantillon et sa complexité.
Lors de l’exécution de la digestion en solution, les protéines sont dénaturées avec des agents chaotropiques puissants, puis par un agent réducteur. Ces protéines réduites, dénaturées, sont ensuite alkylées pour empêcher de manière irréversible que des liaisons disulfures ne se reforment. Les protéines alkylées sont ensuite digérées par des endoprotéinases qui rompent hydrolytiquement les liaisons peptidiques pour fragmenter les protéines en peptides.
La digestion en solution est idéale pour travailler avec un petit échantillon, l’extraction de peptides basée sur la digestion en gel pouvant entraîner une perte significative de peptides. La digestion en solution est préférable aussi pour les échantillons d’une complexité faible à modérée, là où des détergents auraient des effets négatifs sur l’échantillon. La digestion en solution est choisie de préférence du point de vue de la durée et de l'automatisation. Non seulement son exécution est plus rapide, mais elle est aussi généralement automatisée.
La séparation des protéines par électrophorèse sur gel utilise l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS pour dénaturer et séparer les protéines d’un échantillon. Après l’électrophorèse, les bandes de protéines son visualisées, puis excisées du gel. Les bouchons de gel peuvent ensuite être réduits, alkylés et digérés. Les peptides sont ensuite extraits de la matrice de gel qui peut être ensuite préparé pour l’analyse par MS.
L’un des avantages de la digestion en gel est le fait qu’elle combine la dénaturation des protéines et la séparation, indiquant visuellement l'abondance relative des protéines de l’échantillon. L’extraction des peptides retire aussi une grande partie des détergents et des sels, bien que cela puisse affecter la récupération des peptides.
Enrichissement des peptides
L’enrichissement des peptides cibles a lieu dans la phase finale de préparation de l’échantillon pour la spectrométrie de masse. Cette phase, ainsi que le nettoyage de l’échantillon, est nécessaire pour réussir l'analyse des protéines peu abondantes ou identifier des peptides aux modifications post-traductionnelles.
L’enrichissement est effectué par purification par affinité en utilisant des anticorps ou ligands spécifiques qui se lieront de manière sélective aux composés cibles.
Les sels et les tampons peuvent être retirés après l’enrichissement des peptides en utilisant des colonnes d'affinité ou des réactifs détergents précipitants. Les concentrateurs peuvent aussi être utilisés dans des échantillons dilués qui sont disponibles dans une variété de plages de « rétention » de poids moléculaire (MWCO).
À ce moment-là, l’échantillon de peptide purifié est prêt pour la préparation finale de l’analyse par MS. Dans le cas de l'analyse par LC-MS ou LC-MS/MS, il est crucial de bien choisir les phases mobiles et les réactifs d'appariement d'ions pour obtenir une bonne résolution LC pour des résultats d'analyse de qualité.
Raisons de l’échec de l'analyse des protéines
Un certain nombre de facteurs peut faire dérouter la préparation de votre échantillon, entraînant ainsi une mauvaise analyse par spectromètre de masse. L’un des obstacles les plus courants rencontrés avec la spectrométrie de masse est la complication et l'incapacité de l'analyse à d’identifier les acides aminés. Voici les erreurs les plus courantes derrière cette erreur :
- Mauvaise digestion des protéines
- Le peptide hydrophile/de petite nature traverse la colonne d'arrière-plan avec le sel et ne peut pas être analysé
- Faible fragmentation - les peptides sont hydrophobes ou trop grands et ne peuvent pas être retirés de la colonne ou sont trop grands pour être analysés par MS
- Il n’est pas possible d'analyser les voies de fragmentation des peptides. Plusieurs spectres sont inexpliqués dans l’analyse
Choses à éviter lors de la préparation d'un échantillon de protéine
Ionisation et concentration de l’échantillon
Les techniques d'ionisation utilisées pour de grandes molécules fonctionnent souvent bien lorsque les quantités de constituants contenues dans le mélange d’échantillon sont égales. Vous pouvez rencontrer des problèmes en cas de déséquilibre sur ce point. Pour les échantillons où le degré d'abondance des protéines est élevé, les protéines plus abondantes ont tendance à supprimer les signaux des moins abondantes.
Simplifiez votre échantillon
L'analyse du spectre de masse d'un mélange complexe constitue déjà un défi en raison du grand nombre de composants. Ceci peut être exacerbé encore davantage par la digestion enzymatique d'un échantillon de protéine en un grand nombre de produits de peptides. La réussite de l’analyse dépend d'un échantillon propre et dont la complexité est limitée. Il est important de minimiser toute complexité qui causerait la suppression de l’ionisation ou le sous-échantillonnage de peptides s’échappant.
Échantillons complexes et enrichissement
La difficulté éventuelle de détecter des protéines à l’état de traces lors de leur présence à des concentrations beaucoup plus faibles que d'autres produits biologiques constitue l’un des défis de la spectrométrie de masse. Il est possible d’y remédier en surchargeant la colonne, mais ceci se fait au détriment de la suppression de l’ionisation et de la saturation du détecteur de MS. L’enrichissement des échantillons par déplétion des protéines du produit est un objectif à long terme dans ce domaine qui a connu un certain succès.
Avantages et inconvénients de la spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse présente des avantages distincts en tant que technique d'analyse :
- Sensibilité accrue par rapport à la plupart des autres techniques d'analyse
- Un filtre masse-charge réduit les interférences de fond
- Excellente spécificité utilisant des modèles de fragmentation pour identifier des inconnus ou confirmer la présence de composés
- Informations sur le poids moléculaire. Identifier des composés inconnus
- Données sur l'abondance isotopique d’éléments
Cependant, il existe un certain nombre d'inconvénients :
- Échec à distinguer entre des isomères optiques et géométriques
- Échec à différencier les positions des substituants (en positions o, m et p)
- Limitations dans l'identification des hydrocarbures qui produisent des ions fragmentés similaires
Même avec ces risques et limitations mentionnées en détail ci-dessus, les variations du type d’échantillon constitueront le plus grand défi de la spectrométrie de masse auquel vous serez confronté. Chaque échantillon aura une constitution unique et peut même être reçu à différents niveaux du processus de préparation de l’échantillon.
La clé de votre succès est de comprendre l’utilisation de ces paramètres pour produire des échantillons compatibles avec le spectromètre de masse. Ceci nécessitera de la flexibilité, de la créativité et la compréhension de nombreuses options que nous avons abordées dans la préparation d'un échantillon. Veuillez visiter Avantor pour obtenir de plus amples informations sur les tests analytiques, les tout derniers développements en chromatographie et en spectrométrie de masse.